引言

细胞无菌试验是生物制药、细胞治疗产品及细胞培养研究中的关键质量控制环节，旨在确保细胞样本或相关生物制品中不存在外源性微生物污染。微生物污染可能来源于操作环境、培养基、设备或操作人员，可能导致细胞功能异常、实验结果失真甚至临床治疗失败。随着细胞治疗技术的快速发展，无菌试验的标准化和精准性要求日益提高。本文将从检测范围、项目、方法及仪器等方面，系统阐述细胞无菌试验的技术要点和科学意义。

检测范围

细胞无菌试验的检测范围覆盖以下领域：

• 生物制药：细胞基质生产的疫苗、抗体药物等；
• 细胞治疗产品：CAR-T细胞、干细胞制剂等；
• 科研用细胞库：实验室长期保存的细胞株或原代细胞；
• 临床样本：移植用组织工程产品或细胞悬液。

此外，培养基、培养耗材及关键生产设备的无菌性验证也需纳入检测范畴。

检测项目

根据《中国药典》及国际标准（如USP<71>），细胞无菌试验的核心检测项目包括：

• 需氧菌与厌氧菌检测：如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等；
• 真菌检测：包括酵母菌和丝状真菌（如黑曲霉）；
• 支原体检测：通过培养法或分子生物学方法进行验证；
• 特定病原体筛查：针对产品用途定制检测（如内毒素、分支杆菌）。

检测方法

传统培养法

通过将样本接种于液体硫乙醇酸盐培养基（用于需氧菌/厌氧菌）和胰酪大豆胨液体培养基（用于真菌），在30-35°C和20-25°C下分别培养14天，观察培养基浊度变化。此方法灵敏度高，但耗时长，需结合阴性对照排除假阳性。

分子生物学方法

基于PCR或qPCR技术，通过特异性引物扩增微生物DNA（如16S rRNA基因）。支原体检测常用荧光染色法（Hoechst 33258）结合DNA探针杂交，可在24-48小时内完成，尤其适用于快速放行检测。

快速微生物检测系统

采用生物发光法（ATP检测）或流式细胞术，通过检测微生物代谢活性实现实时监测。例如，BacT/ALERT®系统通过监测CO₂浓度变化判断微生物生长，将检测周期缩短至5-7天。

检测仪器与设备

• 生物安全柜：提供A2级无菌操作环境，避免样本交叉污染；
• 全自动培养箱：精准控制温度、湿度及CO₂浓度（如Thermo Scientific Heracell系列）；
• PCR仪：用于支原体或特定病原体的核酸扩增（如Applied Biosystems QuantStudio）；
• 荧光显微镜：观察支原体染色后特征性荧光斑点（1000倍油镜）；
• 微生物鉴定系统：VITEK®2或MALDI-TOF MS用于污染菌种属鉴定。

结果判定与质量控制

试验需设置阳性对照（接种标准菌株）和阴性对照（未接种培养基）。若实验组与阴性对照组均无微生物生长，判定为“无菌生长”；若实验组与阳性对照组同步出现生长，则判定为污染。需注意假阴性风险（如微生物受抑或样本量不足），必要时进行方法学验证。

技术挑战与发展趋势

当前主要挑战在于：1）低丰度微生物的检出限提升；2）病毒污染检测的标准化缺失。未来趋势包括：

• 整合宏基因组测序（mNGS）技术实现广谱病原筛查；
• 开发微流控芯片实现高通量快速检测；
• 人工智能辅助的图像分析系统提高判读效率。

结论

细胞无菌试验是细胞产品质量控制的核心屏障，需结合传统方法与新兴技术构建多层次检测体系。严格的试验设计、标准化操作及设备验证是保障结果可靠性的关键。随着监管要求的升级和技术迭代，无菌检测将向更灵敏、更的方向发展，为细胞治疗产品的临床转化提供坚实保障。

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